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    研究進展

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    彭海琳教授課題組與合作者 Nature Methods:超平整石墨烯/均勻薄冰支撐膜用于高分辨冷凍電鏡成像

    日期:2022-12-20 10:05:22    作者:市場運營部    瀏覽量:3386 次


    摘要:近日,北京大學化學與分子工程學院/北京石墨烯研究院彭海琳課題組、清華大學生命科學學院王宏偉課題組和北京大學工學院韋小丁課題組合作在《自然-方法學》Nature Methods發表了題為“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”的研究論文,報道了新型超平整石墨烯電鏡載網,破解了高分辨冷凍電鏡表征中均勻薄冰的制備難題。該工作表明,超平整石墨烯/均勻薄冰支撐膜能顯著提升冷凍電鏡成像質量和效率,實現多種小蛋白(分子量小于70 kDa)的高分辨三維重構。


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    圖1 懸空石墨烯冷凍電鏡支撐膜的平整度影響冰層厚度均一性和成像質量


    單顆粒冷凍電鏡是目前揭示生物大分子精細結構和反應機理的重要手段之一。在冷凍電鏡成像過程中,生物大分子被封裝在薄層玻璃態冰中,在電子束輻照下,仍處于原始結構和本征狀態。實驗表明,均勻薄冰層的制備是實現高分辨冷凍電鏡成像的關鍵因素之一,尤其是對于分子量較小的蛋白(小于100 kDa),因為冰層過厚會嚴重影響信噪比,無法實現高分辨率結構重構。然而,樣品制備過程中,冰層厚度和均一性目前仍難以精確控制,已成為高分辨冷凍成像的主要挑戰之一。


    針對該關鍵問題,北京大學彭海琳課題組、清華大學王宏偉課題組及北京大學韋小丁課題組合作,揭示了冷凍電鏡樣品支撐膜的表面粗糙度和冰層均一性的關系,并開發了超平整石墨烯電鏡載網,解決了均勻薄冰的制備難題。研究表明,超平整石墨烯支撐膜能形成更薄更均勻的玻璃態冰,背景襯度低,有利于高信噪比和高分辨率的冷凍電鏡成像?;诔秸?均勻薄冰支撐膜,他們對三種分子量較小的鏈霉親和素蛋白(streptavidin,52 kDa)、血紅蛋白(hemoglobin,64 kDa)和甲胎蛋白(α-fetoprotein,67 kDa)進行結構解析,分別得到了2.2 ?、3.5 ?和2.6 ?的高分辨率重構。進一步的,他們還證明該超平整石墨烯載網在冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)等領域有良好的應用前景。


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    圖2  超平整石墨烯載網的設計、制備與力學性質表征


    彭海琳課題組與劉忠范課題組前期合作開發了銅(111)/藍寶石晶圓上超平整石墨烯單晶的外延生長方法和批量制備技術。在此基礎上,彭海琳課題組基于超平整石墨烯單晶晶圓和“面對面”超潔凈無膠轉移方法,成功實現了超平整懸空石墨烯電鏡載網的批量化制備,單層石墨烯懸空膜完整度高達98%,平均表面粗糙度低至0.7 nm。原子力顯微鏡(AFM)納米壓痕技術的力學表征結果表明,超平整石墨烯支撐膜具有接近于石墨烯理論值的楊氏模量和斷裂強度,遠高于粗糙起伏有褶皺的石墨烯。進一步分析表明,超平整石墨烯支撐膜具有約0.2 N/m的預應力,而預應力是制備均勻薄冰的關鍵因素。冷凍制樣過程中,在滴加樣品溶液后,需要用濾紙吸走支撐膜上的多余液體以制備薄層液膜。該過程會產生很大的剪切力(kPa量級),導致樣品液膜產生起伏,進而造成冰層的起伏。超平整石墨烯中預應力的存在使其能抵消剪切力產生的影響,即使在100 kPa的剪切力下依然保持平整。


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    圖3 超平整石墨烯顯著提高冷凍電鏡成像質量,成功解析streptavidin(52 kDa)的高分辨三維重構


    他們將超平整石墨烯載網用于冷凍電鏡成像中,發現形成的均勻薄冰能顯著提高成像質量。一方面,預應力使得冰層在電子束輻照下不易發生翹曲,有效抑制了樣品在表征時的漂移。另一方面,在不同的傾轉角度下(-60°~60°),石墨烯表面均無褶皺結構,避免了高角度成像時褶皺對樣品信號的遮蔽。經過測量,超平整石墨烯支撐膜所制備的冰層厚度約為20 nm,且厚度比較均勻,既可有效封裝生物大分子顆粒,也不會過多引入額外的背景噪音。大多數生物大分子顆粒吸附于石墨烯表面,幾乎處于同一高度,降低了成像時同一視野下局部欠焦值的差異。與粗糙起伏的石墨烯對比,超平整石墨烯保證了高質量數據的收集,提升了成像效率。綜合以上優勢,作者利用新型超平整石墨烯載網對三種小蛋白streptavidin(鏈霉親和素蛋白,52 kDa)、hemoglobin(血紅蛋白,64 kDa)和α-fetoprotein(甲胎蛋白,67 kDa)進行冷凍電鏡結構解析,分別得到了2.2 ?、3.5 ?和2.6 ?的高分辨率結構重構。


    該研究工作以“超平整石墨烯/均勻薄冰支撐膜用于高分辨冷凍電鏡成像”(Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM)為題,于2022年12月15日發表在《自然-方法學》(Nature Methods)。北京大學化學與分子工程學院彭海琳教授、清華大學生命科學學院王宏偉教授、劉楠博士以及北京大學工學院韋小丁教授為論文共同通訊作者,北京大學化學與分子工程學院博士畢業生鄭黎明、清華大學生命科學學院劉楠博士、北京大學化學與分子工程學院博士生高嘯寅以及北京大學工學院博士畢業生朱文清為論文共同第一作者。該工作得到國家自然科學基金、國家重大科學研究計劃、北京分子科學國家研究中心、北京生物結構前沿研究中心、清華-北大生命科學聯合中心、中國博士后科學基金、騰訊基金會等資助,并得到了北京大學化學與分子工程學院的分子材料與納米加工實驗室(MMNL)儀器平臺的支持。


    論文鏈接:

    https://www.nature.com/articles/s41592-022-01693-y


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